細胞培養，生命科學研究的基石，卻也常是新手科學家的“噩夢”。一招不慎，滿盤皆輸——污染、狀態差、莫名死亡… 如何在這片“江湖”中立足？這份融匯權威指南與實戰經驗的秘籍，助你功力大增！

超凈工作臺/生物安全柜：操作核心區域！使用前紫外滅菌≥30分鐘，關閉后通風10分鐘再操作；臺面及放入物品表面均需用75%乙醇徹底擦拭。

個人防護：實驗服、手套（操作前噴酒精）、口罩、護目鏡缺一不可。

培養基、胰酶（Trypsin）、PBS等使用前需37℃水浴預熱約15分鐘。警惕：長時間預熱會導致成分（如生長因子、谷氨酰胺）降解！

完全培養基：基礎培養基 (如DMEM/ RPMI-1640) + 10%胎牛血清 (FBS) + 1%雙抗 (青霉素鏈霉素)；FBS需-20℃保存，避免反復凍融。

HyClone基礎培養基

HyClone胎牛血清

HyClone青霉素-鏈霉素溶液

胰蛋白酶-EDTA：常用濃度0.05%-0.25%，4℃保存，使用前預熱。關鍵：消化前必須用無鈣鎂離子的PBS充分沖洗細胞，去除血清抑制。

HyClone 胰蛋白酶溶液

凍存液：90% FBS + 10% DMSO，現配現用；DMSO有毒性且溶解放熱，勿直接加入細胞懸液。

谷氨酰胺：細胞生長必需！極不穩定，需-20℃單獨保存，使用時加入培養基。含谷氨酰胺的培養基4℃儲存超過2周需補加。

準備：預熱完全培養基，備好含5-10mL培養基的離心管；

速融：從液氮取出凍存管（戴防護面罩防炸管），立即投入37℃水浴，輕柔但快速搖動，1-2分鐘內完全融化；

稀釋離心：酒精擦拭凍存管外壁。將細胞懸液轉移至含預熱培養基的離心管中，混勻（稀釋DMSO毒性）。800-1000 rpm 離心5分鐘，棄上清；

重懸培養：用新鮮預熱培養基輕柔重懸細胞，接種至培養瓶，補足培養基，并標記細胞信息；

關鍵點：24小時后務必換液，去除殘留DMSO和死細胞。

2.1看時機：顯微鏡下確認細胞密度達80-90%匯合。過密影響狀態，過稀延長停滯期。

2.2清殘留：吸棄舊培養基。關鍵：加入PBS輕柔搖晃清洗1-2次，徹底去除殘留血清（抑制胰酶）。

2.3巧消化 (核心)：加入適量預熱的胰酶（如T25瓶加0.5-1 mL），輕輕搖動覆蓋細胞層；37℃孵育，需密切顯微鏡觀察（30 s-1 min觀察一次），觀察到細胞變圓、間隙增大（非完全脫落）立即終止；

終止：加入2-3倍胰酶體積的含血清完全培養基。

2.4輕柔吹打：用移液管按順序、貼壁吹打瓶壁，使細胞脫落形成單細胞懸液。避免產生氣泡、暴力吹打造成物理損傷。對于難消化細胞，可“分層消化”，先收集已脫落細胞。

2.5離心分瓶：細胞懸液離心（同復蘇），棄上清，之后用新鮮培養基重懸，按合適比例（參考細胞特性，如HEK293常1:5-1:10，干細胞1:2-1:3）分入新瓶，補足培養基，混勻。

直接法：讓細胞自然沉淀（5-10分鐘），吸棄部分（1/2-2/3）舊培養基，補足新鮮培養基，混勻后按比例分瓶。

離心法：細胞懸液轉移至離心管，離心（同貼壁細胞），棄上清，新鮮培養基重懸，按比例分瓶。

要訣：懸浮細胞對密度更敏感，需嚴格按推薦密度傳代，避免過密或過稀。

4.1選良材：選擇對數生長期、狀態良好的細胞。凍存前一天可換液。

4.2制懸液：按傳代方法消化收集細胞，離心棄上清。用預冷的凍存液重懸細胞，調整密度至5×10? ~ 1×10? cells/mL。分裝至凍存管（1-1.5 mL/管），標記清晰（名稱、代數、日期）。

4.3程序降溫 (成敗關鍵)：

黃金法則：慢凍（約1℃/min）減少冰晶損傷。

經濟法（凍存盒）： 4℃ 30 min → -20℃ 2小時 → -80℃過夜 → 次日轉入液氮長期保存。強調：4℃平衡30 min不可省，利于凍存液滲透。

最優法：程序降溫儀。

4.4驗真身：凍存24小時后，復蘇一管檢測活性和是否污染。

1.1勤觀察：每日顯微鏡檢查！看形態、密度、有無污染（渾濁、漂浮物、菌絲）；

1.2定期換液：一般每2-3天，高密度細胞需更勤；培養基變黃（酸中毒）是強烈信號；

1.3培養箱維穩：嚴格監控CO?(5%)、濕度(>95%)，定期滅菌水盤；

1.4控制代數：使用低代數細胞（通常< passage 20），定期更換新批次，避免遺傳漂變。

1. 雙抗用不用？非必需！長期使用可能掩蓋輕度污染并產生耐藥性，可以根據實驗室潔凈度決定。

2. 細胞碎片多？貼壁細胞：PBS沖洗2-3遍；懸浮細胞：PBS重懸離心洗滌2-3遍。

3.-80℃能存多久？僅適合短期（1-2周），長期保存必須用液氮。

4. 培養瓶蓋子怎么擰？密閉蓋：旋進約2/3，預留縫隙通氣。透氣蓋;按說明操作。

5. 細胞不貼壁？檢查：消化是否過度？新血清批次是否不適應？培養皿是否需要包被（如原代細胞）？

6. 細胞狀態差（顆粒多、生長慢）？排查：支原體污染？血清質量問題（換批次/品牌）？CO?濃度不準？培養基過期或配制不當？

7. “慎與勤”心法 ：

慎防污染、慎操作（溫柔）、慎思（步驟清晰）；

勤消毒（臺面、手）、勤換液傳代凍存、勤觀察。