mRNA合成及GMP生產解決方案
mRNA GMP生產工藝流程
一． 質粒構建，擴增以及提取
1. mRNA 模板序列優化及質粒構建服務
GOI/UTR序列優化、定制polyA長度、修飾核苷酸替代
2. 質粒構建產品
Fast Digest限制性內切酶、T4 DNA 連接酶、Phusion Plus高保真DNA聚合酶
 | FastDigest 限制性內切酶是為快速DNA酶切專門研發的高級限制性內切酶。在30多年內切酶的研究中，大量可供選擇的同裂酶和卓越的生產能力促使這個包含176種FastDigest限制性內切酶的獨特系統的誕生。此外，FastDigest Green 綠色緩沖液兼具上樣緩沖液的功能，可直接將反應物上樣凝膠電泳，操作更為便利。 |
 | T4 DNA 連接酶催化雙螺旋 DNA 或 RNA 中并排的 5-磷酸基和 3-羥基端之間磷酸二酯鍵的形成。該酶可以修復雙螺旋 DNA、RNA 或 DNA/RNA 雜合體中的單鏈缺口。其還可以將 DNA 片段與黏性末端或平末端結合，但對單鏈核酸無活性。T4 DNA 連接酶需要ATP作為輔因子。 |
 | 高保真PCR酶具有 3′-5′核酸外切酶校對活性。當結合錯誤匹配的堿基時，DNA聚合酶停頓，導致合成暫延。合成暫延允許去除錯誤匹配的核苷酸并使用正確的核苷酸取代，從而大大提高擴增序列的準確性。Phusion Plus高保真DNA聚合酶是Phusion產品家族的新成員，它是融合了DNA結合結構域的類熱球菌高保真酶。這種獨特的蛋白質融合技術使Phusion Plus DNA聚合酶能夠獲得具有高準確度、靈敏度和抑制劑耐受性的PCR序列。此外，其專門配制的反應緩沖液使您無需計算引物退火溫度即可進行PCR擴增，從而幫助節省時間并避免PCR運行中的錯誤。 |
3.質粒轉染進大腸桿菌
 | TurboFect 體外轉染試劑是一種專門的陽離子聚合物的無菌水溶液。聚合物和DNA一起形成結構緊湊，穩定帶正電荷的復合物，保護DNA不被降解，從而有助于基因導入真核細胞。TurboFect是多種細胞轉染的理想試劑，包括原代細胞和難轉染的細胞。轉染可以在在含血清或無血清條件下進行。和其他轉染試劑相比，TurboFect展示了出色的轉染效率和較小的毒性。 |
4. 大腸桿菌大規模培養
 | ? 使用完全透明、抗裂、不含雙酚A（BPA）的PETG制成 ? 10-6的無菌保證水平（SAL） ? 一次性使用，以減少交叉污染并無需清洗 ? 帶刻度，方便估計液體體積 ? 可根據要求提供驗證手冊，以幫助您快速啟動驗證過程 ? 可選擇密閉或帶過濾膜的瓶蓋，便于適量的氣體交換 ? 平底或擋板底部，以滿足減少剪切力或改善通氣的需要。 |
 | T&J-Atype質粒培養生物反應器生物反應器/發酵罐提供更強功能和更多選擇，滿足工藝開發表征中的苛刻要求，適用于質粒DNA（PDNA)大規模生產、病毒載體生產、質粒表達、培養基優化、慢病毒制備、生產、懸浮細胞發酵法、采用貼壁細胞大規模生產慢病毒、采用懸浮培養生產慢病毒、重組大腸桿菌生產二倍體質粒的研究。 |
5.GMP質粒下游工藝
菌體收集： 平板膜包；澄清過濾： stax深層膜堆；濃縮換液： 超濾膜包；制劑混合：一次性攪拌罐；除菌灌裝： 除菌濾器
澄清過濾 | ? 高處理量 (50 ? 20,000 L) ? 小系統<1 m2 (<10 ft2) ? 操作簡易 ? 功能多樣 ? 可線性放大 ? 使用成本低 ? 核心材質：Seitz 系列濾板 ? 內部結構：Supradisc II 膜堆構造 |
濃縮換液 | Omega PES膜材質的T系列膜包專為研發、中試以及生產規模的TFF應用而設計，結合材料和設計方面的顯著改進，具有更可靠的流體動力學參數，T系列膜包適配于Centramate夾持器，可以提供最小200cm2 (0.215ft2)到0.5m2(5.4ft2)不同的有效過濾面積(EFA) |
除菌過濾
除菌過濾型號 | 濾膜材質 | 產品特性及優勢 | 除菌過濾驗證 | 漸變預過濾膜層 | 適用料液 |
Supor EKV | 獨特的高密度非對稱雙層聚醚砜濾膜（PES) | 良好的結構和過濾性能； 超級打褶的過濾器結構和小內核設計； 高病毒回收，有效保障無菌工藝； 綜合了良好的容污能力(壽命)和產品回收率。 | 經過驗證, 有《驗證指南》 備索 | 表層濾膜0.65μm，底層濾膜0.2μm | 常規滴度（<106) |
Supor ECV | 表層濾膜0.2μm(公稱精度)，底層濾膜0.45μm | 高滴度 (106-108) |
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從針頭濾器到30寸濾芯的不同規格尺寸，滿足從實驗室到生產規模的各種需求。
 | Allegro 2D 生物容器經過特殊設計，尤其適用于需要 可靠而靈活的生物容器的應用。可提供50 ml到 50L的2D生物容器，整合了生物容器的一次性 系統是經已證明的經濟有效的替代設備，可替代玻璃、不 銹鋼和硬塑料等材質的容器。這些一次性系統廣泛用于生 物制藥行業的上游、下游和制劑灌裝工藝。 |
 | Palltronic Flowstar V 完整性檢測儀根據現行的 GAMP 指南開發并驗證，可適用于所有潔凈室環境。它具有能夠在符合21 CFR Part 11要求的環境中運行的全面技術控制和功能，同時還具有質量風險管理功能，如數據完整性控制和電子記錄/電子簽名。 |
6. 質粒純化：
Invitrogen PureLink Expi 低內毒素及無內毒素質粒提取試劑盒；GENEJET 質粒制備試劑盒，GENEJET PCR純化試劑盒。
 | Invitrogen PureLink Expi 無內毒素質粒純化試劑盒采用新型專有陰離子交換樹脂，以現行標準方案約一半的時間分離高級轉染級質粒 DNA，獲得內毒素水平低于 0.1 EU /μg 的質粒，推薦應用于敏感細胞（原代細胞、干細胞）的轉染、基因療法研究、基因組工程和蛋白質表達等。 |
二.質粒酶切、線性化，體外轉錄合成 mRNA
1.修飾核苷酸
2.限制性內切酶，T7 RNA聚合酶，轉錄酶
3.轉錄后修飾：Cap0 牛痘病毒加帽酶、 Cap1 2’-O-甲基轉移酶，PolyA加尾酶
4.RNA抑制酶，DNA酶（降解模板DNA），無機焦磷酸酶
三. mRNA GMP純化及制劑：
1. 切向流過濾（純化濃縮）：
Omega T 300KD PES 切向流膜包
 | Omega PES膜材質的T系列膜包專為研發、中試以及生產規模的TFF應用而設計，結合材料和設計方面的顯著改進，具有更可靠的流體動力學參數，T系列膜包適配于Centramate夾持器，可以提供最小200cm2 (0.215ft2)到0.5m2(5.4ft2)不同的有效過濾面積(EFA)。 |
2. 離子交換層析：
Mustang Q 膜層析
 | ? 大孔道:0.8μm開放性孔道，更易捕獲大分子（大分子量的蛋白，DNA和病毒）； ? 傳輸流:在大孔道中大病毒顆粒（20-150nm）有更快的質量傳遞，與Q基團接觸﹑結合﹑洗脫無障礙，動態載量不受高流速限制； ? 低壓力、低剪切力:保護脆弱病毒粒子； ? 化學兼容性好:再生容易，有效節約經濟成本； ? 高流速（10MV/min)，低壓差，有效縮短工藝時間； ? 高載量，高分辨率，高回收。
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3. mRNA與正電荷材料復合（微流控包裝LNP）：
PNI NanoAssemblr 平臺解決方案。
4：LNP純化/濃縮：
SPTFF單向切向流技術平臺
 | ? 無回流/循環管路 ； ? 流量比率控制 (FRC) ； ? 5-10X 濃縮倍數低進料速度； ? 2-3X 縮小管路尺寸 ； ? 無需按照批次進行 ； ? 更小工作體積易于回收 ； ? 無混合或氣泡問題，低剪切作用。
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