各位小伙伴有沒有遇到過這樣的情況：

明明嚴格按照步驟來，結果卻總是差那么一點？

洗滌步驟到底要做到什么程度才算合格？

溫育時間稍微有點偏差會不會影響結果？

顯色反應的終止時機，到底怎么判斷才最準確？

今天咱們就來好好嘮嘮那些 ELISA 實驗里容易被忽略卻又至關重要的操作要點，看看能不能解決大家的這些 “小煩惱”。

血清樣本、抗原和抗體都需要稀釋，稀釋的準確性關系到檢測的精確性。注意所用的移液器、吸頭和容器一致。稀釋完成后保證混合均勻。

加樣時要加在板孔底部，避免加在孔壁和濺出，不能產生氣泡。加入不同的物質時要更換吸頭，避免交叉污染。在加顯色液時，最好使用多道移液器，使加樣時間盡量統一，減小結果誤差。

洗滌主要目的是去除殘留的未與固相載體上的抗原或抗體結合的物質、游離的酶標記物、以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體上的干擾物質等。如果洗滌不完全，可能會導致背景吸光度值偏高，從而影響實驗結果的準確性。

洗滌次數 ：通常情況下，洗滌次數應不少于 3 次，部分實驗要求洗滌 6 次或更多，以確保盡可能去除未結合的物質。

洗滌時間 ：洗滌過程中，洗液在孔中的停留時間也很重要，一般可選擇 1 - 5 分鐘的靜止時間，讓洗液充分作用，使各個孔的結合和洗滌情況趨于一致。

洗滌液量 ：洗滌液的量要足夠，一般建議洗滌量使用 300 μl 及以上，且所有孔中的洗滌體積必須相等，以保證洗滌效果。

洗滌后殘留 ：洗滌后，孔內不應有明顯的殘留液體或雜質，可通過觀察孔內是否清澈、無殘留物來初步判斷。

孵育溫度：不同品牌的試劑盒孵育溫度不同，一般為37℃、室溫或4℃。

孵育時間：孵育時間過長可能會導致非特異性吸附，過短可能導致抗體與抗原的結合不充分，一般孵育1-1.5h。

孵育環境：孵育過程中，環境濕度對實驗結果也有一定影響。如果濕度較低，可能會導致孔板中的液體蒸發，影響孵育體積和濃度，進而影響檢測結果孵育；對于一些使用碳酸鹽緩沖液的 ELISA 實驗，二氧化碳濃度也會影響孵育效果。二氧化碳可以與水反應生成碳酸，進而影響緩沖液的 pH 值。

所以孵育操作請嚴格按照試劑盒說明書進行。

顯色是ELISA中的最后一步反應，酶催化底物產生顯色反應。反應溫度和時間是影響顯色的關鍵因素。適當提高溫度有助于加速顯色，一般情況下，當標準品的高濃度孔（如 S1 孔）出現明顯的顏色反應，如淡藍色，而低濃度孔（如 S5 孔）也有淡淡的藍色，同時空白孔（Blank 孔）無明顯藍色時，即可認為顯色達到一定程度，可以終止反應。

產品介紹